CRISPR/Cas9基因敲除

  1. 简介

CRISPR-Cas系统（The clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats-associated protein systems）是一个细菌及古细菌进化出来用以抵御病毒和质粒入侵的适应性机制。该体系其中一个最重要的优势是Cas9蛋白可在多个不同的gRNA的引导下同时靶向多个基因组位点。该切割DNA的机制于2012年被证实广泛适用于真核生物，从而引发了后续的以CRISPR/Cas9为基础的第三代基因编辑工具的研究热潮。CRISPR-Cas系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种生物，包括斑马鱼、小鼠、大鼠、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。相比于ZFN系统和TALEN系统， CRISPR-Cas9系统的可用位置更多，理论上基因组中每8个碱基就能找到一个可以用CRISPR-Cas9进行编辑的位置，可以说这一技术能对任一基因进行操作。

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  1. 爱默基因优势
  • RNA导向的基因组DNA识别，无需考虑DNA甲基化
  • 较ZFN和TALEN，有相同或更高的基因编辑效率
  • 可同时编辑多个基因（多重靶向编辑）
  • 设计简单快速，无需重复构建核酸内切酶
  • 本公司提供的质粒均来源于最新的顶尖杂志中已使用过的系统，其有效性已被反复被验证。
  • 靶点的筛选: 不同靶点的有效性存在差异，本公司免费为您设计三个特异性靶点。
  • 载体系统的构建：双质粒转染系统、lentiCRISPR单质粒慢病毒系统，根据客户的不同需要，提供个性化载体构建服务
  1. 实验流程

gRNA设计——gRNA载体构建——gRNA载体与Cas9载体共转染细胞——筛选单克隆细胞系——WB及测序验证

  1. CRISPR/Cas9技术特点
  • CRISPR-Cas9系统的可用位置更多。理论上基因组中每8个碱基就能找到一个可以用CRISPR-Cas9进行编辑的位置，可以说这一技术能对任一基因进行操作，而TALEN和ZFN系统则在数百甚至上千个碱基中才能找到一个可用位点，这大大限制了使用范围。
  • CRISPR-Cas9系统的使用极为方便，只需要替换一段核酸序列，几乎任何实验室都可以开展工作。
  • 不引入任何外源性DNA进入目标基因区域（仅限基因敲除项目）
  • 与ZFNs和TALENs相比更加简单高效
  • 可以用于建立基因插入和基因敲除的细胞系
  • 被誉为2013年重大学术突破之一
  1. 结果展示

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图A为CRISPR/Cas9敲除Gene X后进行western blot验证结果，可以看到在野生型L929细胞系中Gene X正常表达，在CRISPR/Cas9敲除后的Gene X KO L929细胞中Gene X不表达，表明CRISPR/Cas9成功敲除了L929中的Gene X。

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图B为用带GFP荧光的HSV-1感染细胞42h后进行荧光观察，结果显示，与野生型L929细胞相比，CRISPR/Cas9敲除后的Gene X KO L929细胞抗HSV-1感染的能力大大减弱。

  1. 应用领域
  • 基因编辑细胞系构建– 构建knock-out或knock-in细胞系，用于表型分析或药物筛选等
  • 动物模型– 利用CRISPR/Cas9建立转基因斑马鱼、小鼠和猴子等基因改造的动物模型
  • 农业研究–用于农作物基因功能研究，改良作物的抗旱及抗病原性，可避免引入外源DNA
  • 个性化治疗– 从病毒感染者的细胞中去除外源病毒的DNA，治疗HIV及其它传染性疾病
  • 基因组调节– dead Cas9诱导调控靶基因的转录或重新组装DNA
  1. 爱默活动

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